脂肪酸去饱和酶代表一类氧依赖性酶，正在脂肪酸差别地点引入双键，将饱和脂肪酸降饱和为不饱和脂肪酸，催化脱饱和响应，从而发生单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。行为脂肪酸合成途径中的要害酶列入脂肪酸的合成，对微生物脂肪酸双键地点、机合、数目发生特异性影响，不单能够扩充脂肪酸的不饱和度，又有利于督促脂质积聚，对支撑生物膜寻常机合和性能拥有紧急意旨。研讨说明，不管是单表达如故共表达去饱和酶基因，都可正在肯定水准上普及微生物的油脂含量、改进其饱和、不饱和脂肪酸的构成比例。

　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HB1310是1 株已报道的高产油核桃内生菌，饱和酶是该菌株脂肪酸合成途径中的要害酶之一，安徽工程大学的叶景、徐思远、张琴*等人将克隆其去饱和酶基因de1、de2，竣工这两种基因正在i BL21（DE3）中的单表达与共表达，探究去饱和酶基因过表达对E.coli油脂产量及其脂肪酸组分的影响，取得高效的产油工程菌，以期为高产油工程菌的拓荒和使用供应工夫支柱。

　　采用1.0%琼脂糖凝胶电泳对 de1、 de2、 de基因的PCR扩增产品实行检测，结果如图1所示。从电泳图可看出，3 个基因的PCR扩增产品碱基长度约1 036、822、1 856 bp，与预期倾向条带巨细相符，说明这些基因片断扩增获胜。

　　重组表达质粒pET-28a-de1食品、pET-28a-de2、pET-28a-de抽提纯化，区别采用控造性内切酶EcoR I/Xho I、BamH I/Xho I食品、BamH I/Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示，各重组表达质粒酶切后均发生两条带（图2），个中大片断均与质粒pET-28a单酶切片断长度相似，幼片断区别与de1、de2、de基因的主意片断长度相似，进一步测序结果证明3 个基因的重组表达质粒均修建获胜。

　　将重组质粒转化至BL21（DE3）取得工程菌株BL21（DE3）/pET-de1（DE1），BL21（DE3）/pET-de2（DE2）及共表达菌株BL21（DE3）/pET-de（DE），对工程菌株实行PCR检测、质粒及酶切验证，序列比对结果显示工程菌修建获胜。

　　3 工程菌株DE1、DE2、DE去饱和酶基因诱导表达产品的SDS-PAGE领会

　　对工程菌株DE1、DE2、DE去饱和酶基因诱导表达的酶卵白实行SDS-PAGE检测，结果见图3。与 E. coli BL21（DE3）的卵白SDS-PAGE结果实行比拟领会，发明工程菌株DE1、DE2的重组酶正在分子质地约40、32 kDa驾御的条带区别较 E.coli BL21（DE3）显然加深，与表面分子质地较切近（DE1的为39.8 kDa，DE2的为31.8 kDa）。结果说明，去饱和酶基因 de1 、 de2 正在 E.coli BL21（DE3）中竣工了高效单表达和共表达。

　　对工程菌株DE1、DE2、DE培植6 0 h内的OD 600nm 实行监测，其孕育弧线 h驾御达孕育峰值，其后孕育趋于不乱。从培植历程的孕育弧线 株菌株映现与野生菌株好似的孕育弧线，讲明表源的去饱和酶基因 de1 、 de2 单表达和共表达历程中，工程菌株仍能支撑有用的孕育。然而，24～60 h，工程菌株的孕育均略低于野生菌株，大概因为表源基因表达历程中，插入新的酶会形成合成代谢扰乱内源性代谢，合成代谢和内源性代谢之间的逐鹿导致代谢职守，从而导致宿主的应激响应和心理转化，惹起工程菌株孕育量的低重。

　　红四氮唑行为一种氧化剂，能够从去饱和酶承受电子，后自己从无色被还原为血色的甲攒，从而能够表征细胞内去饱和酶活性。工程菌株和野生菌株60 h内的酶活性转化弧线、DE的去饱和酶活性正在60 h诱导历程中均高于野生菌株，尤以24 h的酶活性最高，区别为同时期野生菌株的1.38、1.48 倍和1.75 倍，说明去饱和酶基因 de1 、 de2 正在24 h内即竣工了高程度的表达；24 h后工程菌株酶活性呈消重趋向，大概是因为表源基因的过表达导致 E.co li 中变成洪量的宥恕体。而发酵后期跟着养分物质泯灭以及细菌孕育进入衰弱期 ，去饱和酶活性趋于安定，但仍略高于或与野生菌株的酶活性切近。

　　6 去饱和酶基因de1、de2单表达和共表达对油脂产量及脂肪酸组分的影响

　　为最大水准拂拭大概因为宥恕体的变成导致局部菌株去饱和酶活性消重，而形成后续实践对细菌脂肪酸产量及脂肪酸构成因素的实践过失，本研讨仅搜求了工程菌株和野生菌株发酵24 h的菌体样品实行细菌油脂的提取及其脂肪酸组分领会。

　　如图6所示，去饱和酶基因的表达有用加强了细菌脂质的积聚，与野生菌株比拟，工程菌株的油脂产量和质地分数均明显普及。DE1、DE2、DE的油脂产量区别可达0.57、0.58、0.72 g/L，均较野生菌株普及83%以上，而油脂质地分数从野生菌的9.45%普及至18.44%以上，区别较野生菌株普及97.78%、95.17%、135.09%。总的来看，去饱和酶基因 de1 与 de 2 共表达对油脂产量和含量普及的督促功用明显优于这两个基因单表达的，这与Yan Fengxin等正在解脂耶氏酵母表达Δ12和Δ15去饱和酶基因督促脂质积聚恶果更明显的结论相似。

　　将提取的细菌油脂实行甲酯化后，诈骗气相色谱对脂肪酸组分实行定性和定量领会。基于37 种脂肪酸甲酯混标对油脂样品实行辞别定性，比较程序品参考图谱得出各组分的出峰期间，采用十五烷酸甲酯行为内标对脂肪酸甲酯实行定量领会。菌株脂肪酸组分及其质地分数见表3。

　　表3显示食品，E.coli BL21（DE3）的油脂脂肪酸组分以棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）为主，其次为豆蔻酸（C14:0）、亚油酸（C18:2）。3 株工程菌中油脂脂肪酸仍以上述4 个组分为主，但各组分的质地分数却爆发了显然的转化。个中，C8:0、C15:1、C18:0脂肪酸质地分数均高于野生菌株，更加是工程菌株DE1、DE中的不饱和脂肪酸组分C15:1、C18:2、C22:2质地分数均明显高于野生菌株。为揭示去饱和酶基因de1、de2单表达及共表达对油脂脂肪酸组分的影响，统计了工程菌株DE1、DE2、DE有关于野生菌株中饱和与不饱和脂肪酸的普及量。如图7所示，工程菌株中饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸含量均普及，饱和脂肪酸含量区别普及72.26%、66.93%、123.21%，不饱和脂肪酸含量区别普及112.18%、44.18%食品、134.30%，说明去饱和酶基因的表达有利于E.coli中脂肪酸组分的改进。

　　表面上，去饱和酶特异性地督促成熟脂肪酸中顺式双键的变成，将饱和状况下的脂肪酸去饱和，要害机合域和要害位点组成去饱和酶的活性中央并影响其活性，且差其余催化底物对催化速度也发生肯定的影响。有研讨说明，脂肪酸去饱和酶的类型、表达程度和活性定夺了不饱和脂肪酸的定性和定量构成，卓殊去饱和酶的过表达能够督促细胞内单不饱和脂肪酸的富集和脂质积聚，从而抵达改进脂肪酸组分的恶果。本研讨通过对工程菌株有关于野生菌株中饱和与不饱和脂肪酸含量的普及量实行统计领会，证实了去饱和酶基因的表达有利于E.coli中脂肪酸组分的改进，更加是不饱和脂肪酸含量的普及。表4总结了近年来酵母菌和E.coli中过表达去饱和酶基因惹起菌株不饱和脂肪酸组分和含量转化的研讨结果，可见去饱和酶关于脂肪酸组分的改进至合紧急，过表达差别由来的去饱和酶基因关于高产油工程菌或卓殊组分工程菌的修建拥有紧急使用代价和表面意旨。

　　正在E.coli BL21（DE3）中表达了来自产油核桃内生菌B.subtilis HB1310的去饱和酶基因，修建了单基因表达菌株BL21（DE3）/pET-de1、BL21（DE3）/pET-de2及共表达菌株BL21（DE3）/pET-de，竣工了去饱和酶基因的高表达，有用督促了E.coli去饱和酶活性的普及，使脂肪酸积聚量得以扩充，普及了菌株油脂产量和含量，改进了脂肪酸组分，更加使不饱和脂肪酸含量明显普及。本研讨可为产油脂工程菌的拓荒和使用供应有代价的菌种由来，对高效产油工程菌的修建拥有肯定的使用代价。

　　本文《过表达去饱和酶基因对大肠杆菌脂肪酸合成的影响》由来于《食物科学》2023年45卷第2期72-78页，作家：叶 景，许思远食品，张 琴，钱 程，曹娟娟，赵 沛。DOI:10.7506/spkx0509-076。点击下方 阅读原文即可查看著作联系讯息。

　　实践编纂：天津贸易大学生物工夫与食物科学学院 梁雯菁；职守编纂：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片由来于著作原文及摄图网。

　　为了帮帮食物及生物学科科技职员独揽英文科技论文的撰写手艺、普及SCI期刊收录的掷中率，归纳晋升我国食物及生物学科科技职员的高质地科技论文写作才干。《食物科学》编纂部拟定于2024年8月1—2日正在武汉举办“第11届食物与生物学科高程度SCI论文撰写与投稿手艺研修班”，为期两天。

　　为普及我国食物养分与安然科技自决改进和食物科技家产支柱才干，促使食物家产升级，帮力‘矫健中国’战术，北京食物科学研讨院、中国食物杂志社、国际谷物科技学会（ICC）将与湖北省食物科学工夫学会食品、华中农业大学、武汉轻工大学、湖北工业大学、中国农业科学院油料作物研讨所、中南民族大学、湖北省农业科学院农产物加工与核农工夫研讨所、湖北民族大学、江汉大学、湖北工程学院、果蔬加工与品格调控湖北省重心实践室、武汉食物化妆品考验所、国度市集拘押实践室（食用油质地与安然）、境遇食物学培育部重心实践室联合举办“第五届食物科学与人类矫健国际研讨会”。聚会期间：2024年8月3—4日，聚会住址：中国 湖北 武汉。

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